Mechanizmy chemiczne odpowiedzialne za funkcje życiowe komórek wciąż kryją wiele tajemnic. Nie ma w tym nic zaskakującego: dopiero od niedawna dysponujemy narzędziami pozwalającymi bezpośrednio przyglądać się zjawiskom chemicznym zachodzącym w żywych komórkach. Jednak wskutek wciąż istniejących ograniczeń technicznych do dziś nie mamy na przykład tak podstawowej wiedzy jak ta o wartościach stałych równowagi reakcji chemicznych w komórkach. Innymi słowy, wciąż nie wiemy, jaka część substancji chemicznych zaangażowanych w daną reakcję występuje w komórce w formie przereagowanej, a jaka w nieprzereagowanej.

Dotychczasowe przeciwności pokonała grupa naukowców z Instytutu Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk (IChF PAN) w Warszawie. We współpracy z berlińską firmą PicoQuant GmbH opracowała ona i zademonstrowala modyfikację jednej z najnowocześniejszych technik mikroskopowych: superrozdzielczej spektroskopii korelacji fluorescencji.

–  Reakcjami chemicznymi w komórkach zajmujemy się od dawna. Na przykład w 2013 roku wyznaczyliśmy współczynniki dyfuzji wszystkich białek w bakterii Escherichia coli, dzięki czemu stało się możliwe ustalenie szybkości reakcji przebiegających z ich udziałem. Teraz interesowało nas podobne zagadnienie, tyle że w odniesieniu do sytuacji, gdy mamy małe stężenia reagentów – mówi prof. dr hab. Robert Hołyst (IChF PAN) i kontynuuje: – Reakcje biologiczne są na ogół odwracalne i tam, gdzie zachodzą, zwykle wytwarza się pewna dynamiczna równowaga między ilością substancji przereagowanych a związkami nieprzereagowanymi. Próbując wyznaczyć stałe równowagi dla różnych reakcji w komórkach sięgnęliśmy po superrozdzielczą spektroskopię korelacji fluorescencji. I tu natknęliśmy się na ciekawy problem techniczny, którego rozwiązanie otworzyło nam nowe możliwości w badaniu chemii życia.

Istnieje wiele odmian mikroskopii, w tym o rozdzielczościach tak fenomenalnych, że możliwe jest dostrzeżenie pojedynczych atomów. Jednak przy obserwowaniu komórek bezkonkurencyjna pozostaje mikroskopia optyczna, z uwagi na małą inwazyjność i możliwość obrazowania struktury przestrzennej żywych organizmów. Jej podstawową wadą przez długi czas była słaba rozdzielczość: fundamentalne ograniczenia fizyczne (dyfrakcyjne) powodują, że standardowymi technikami optycznymi nie można rozróżnić szczegółów mniejszych od ok. 200 nanometrów.

Jedną z odmian mikroskopii optycznej jest mikroskopia fluorescencyjna. Polega ona na wprowadzeniu barwnika fluorescencyjnego w badane miejsca próbki biologicznej, a następnie skanowaniu próbki zogniskowaną wiązką lasera. Cząsteczki barwnika znajdujące się w ognisku zostają pobudzone do świecenia. Przepuszczając wyemitowane przez nie światło przez specjalny otwór (konfokalny) można otrzymać obrazy o podwyższonej rozdzielczości. W 1994 roku Stefan W. Hell zaprezentował sposób przekroczenia limitu dyfrakcyjnego w mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą wygaszania emisją wymuszoną (STimulated Emission Depletion, STED). STED wymaga dodatkowej wiązki laserowej, przypominającej w przekroju bajgla, czyli pączek z dziurką.

Odpowiednio użyta, wiązka ta wygasza zewnętrzne obszary ogniska głównej wiązki laserowej i w konsekwencji redukuje jego rozmiary do wartości mniejszych od limitu dyfrakcyjnego. Metodami superrozdzielczymi można dziś dostrzec detale przestrzenne o rozmiarach zaledwie 10 nm przy rozdzielczości czasowej sięgającej mikrosekund.

Stosunkowo młodą gałęzią mikroskopii optycznej jest mikroskopia konfokalna z korelacją fluorescencji (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS). W odmianach superrozdzielczych ognisko lasera ma tu objętość liczoną w dziesiątkach attolitrów (jeden attolitr to miliardowa część  jednej miliardowej litra). Pomiar polega na mierzeniu światła emitowanego przez barwnik  fluorescencyjny doczepiony do badanej cząsteczki, wzbudzony przez wiązkę laserową. Znając rozmiary ogniska i czas trwania fluorescencji oraz wspomagając się odpowiednimi modelami teoretycznymi, można tu dość precyzyjnie ustalić prędkość ruchu nawet pojedynczych cząsteczek.

– Od pewnego czasu było wiadomo, że o ile superrozdzielcza mikroskopia FCS sprawdza się przy obserwowaniu cząsteczek poruszających się w dwóch wymiarach, np. w membranach lipidowych, o tyle zawodzi przy obserwacjach w pewnej objętości. Czasy dyfuzji, wyznaczane na podstawie pomiarów w 3D, potrafiły się różnić od przewidywań z pomiarów w 2D o rząd wielkości, a nawet więcej. Po kilku miesiącach badań stało się dla nas jasne, że za te rozbieżności odpowiada zbyt uproszczony sposób wyznaczania przestrzennych rozmiarów ogniska – mówi dr Krzysztof Sozański (IChF PAN).

Na podstawie własnych analiz teoretycznych oraz doświadczeń warszawscy naukowcy, finansowani z grantów MAESTRO Narodowego Centrum Nauki i ERA Chairs europejskiego programu Horizon 2020, skonstruowali nowy, uniwersalny model teoretyczny, wprowadzający korektę przestrzennego kształtu ogniska i uwzględniający jej wpływ na zmierzony stosunek sygnału do szumu. Poprawność modelu początkowo zweryfikowano w pomiarach szybkości dyfuzji różnych fluoryzujących próbników w roztworach.

– Wykonaliśmy też bardziej zaawansowane eksperymenty. Badaliśmy na przykład odwracalną reakcję, w której cząsteczki barwnika przyczepiały się do micel, a po pewnym czasie się odczepiały. Układ zbudowany ze stosunkowo dużych kulek z cząsteczek surfaktantów reagujących z cząsteczkami barwnika odwzorowywał warunki charakterystyczne dla obiektów biologicznych –  mówi doktorant Xuzhu Zhang (IChF PAN). Pomiary nie były trywialne. Gdyby cząsteczki obu reagentów poruszały się wolno, podczas przechodzenia przez ognisko barwnik mógłby wielokrotnie się łączyć/odłączać z/od micel i emitowane światło byłoby uśrednione. Ale mógł też zajść wariant skrajnie inny: reakcje przyłączania i odłączania przebiegające tak wolno, że w trakcie przejścia przez ognisko nie dochodziłoby do zmian relacji między reagentami – wtedy uśredniania by nie było. „Nasz model uwzględnia nie tylko oba przypadki skrajne, ale także wszystkie pośrednie. A dysponując wiedzą o rzeczywistych rozmiarach ogniska jesteśmy w stanie zmieniać jego wielkość i w tym samym układzie chemicznym i na tym samym sprzęcie przebadać eksperymentalnie wszystkie przypadki wymagane przez model – podkreśla Zhang.

Ważną cechą metody analitycznej opracowanej w IChF PAN jest fakt, że do jej stosowania nie są potrzebne zmiany w aparaturze. Po odpowiedniej adaptacji metoda może być użyta w celu dokładniejszego interpretowania danych zarejestrowanych przez już wyprodukowane mikroskopy korzystające z techniki STED.

Informacja prasowa zrealizowana ze środków europejskiego grantu ERA Chairs w ramach programu Horizon 2020.